Rozpoznanie mikroskopowe zmian w wycinkach pobranych w czasie operacji jest często łatwe, ale nieraz sprawia znaczne trudności. Jednym z warunków dojścia do prawdy jest ścisła współpraca patomorfologa i klinicysty. Chirurg powinien udzielić wszystkich znanych mu informacji o chorym, prawidłowo pobrać wycinek i zabezpieczyć przed zniszczeniem. Najbardziej krytyczny jest okres między pobraniem wycinka a przesłaniem go do pracowni histopatologicznej. Zaangażowanie emocjonalne wszystkich obecnych na Sali operacyjnej dotyczy bowiem chorego, w centrum uwagi są wszystkie akty operacji, bo decydują o życiu. W pośpiechu i napięciu jest łatwo przez nieuwagę zniszczyć tkanki pobrane do badania, zostawiając je np. na parapecie w naczyniu bez utrwalacza.
W celu uniknięcia błędów należy przestrzegać następujących zasad:
1. Każdy fragment tkanki pobrany podczas operacji powinien być zbadany histologicznie, niezależnie od tego, czy zmiana wydaje się bezsporna, czy nie. Badanie mikroskopowe może ujawnić zmiany, których istnienia nie podejrzewa się makroskopowo, a które mogą odzwierciedlać jakiś nieuchwycony przedtem stan chorobowy. (np. w zmienionym zapalnie wyrostku można wykryć guzkowe zapalenie tętnic, a w pozornie prawidłowym pęcherzyku żółciowym – raka).
2. Należy starać się pobrać tkankę zmienioną wraz z marginesem tkanki nie zmienionej.
3. Wycinek musi być natychmiast włożony do utrwalacza. W warunkach codziennych wystarczy roztwór 40% (stężonego) formolu w wodzie z krany (1:9). W szczególnych przypadkach inne utrwalacze trzeba wytypować u przygotować wcześniej. Wycinek umieszcza się w naczyniu o szerokim wlocie w ilości utrwalacza 10 razy większej od objętości tkanki. Świeżą, miękką tkankę jest łatwo wcisnąć nawet do bardzo małego naczynia, ale po utrwaleniu twardnieje ona i nie da się jej wyjąć bez rozbijania słoika. Poza tym utrwalacz nie dociera do tkanki tam, gdzie przylega ona do ścianki naczynia.
4. Jest niedopuszczalne dzielenie na kilka fragmentów w celu wysłania każdego do innej pracowni. Chirurg może nie mieć zaufania do jakiegoś patomorfologa, może chcieć współpracować z kimś innym. Obowiązują jednak lojalność i rozsądek wobec tego, kogo się samemu wybrało. Po prostu w jednej części wycinka mogą znajdować się komórki nowotworowe, w innej masy martwicze, w jeszcze innej prawidłowe tkanki:
Który jest słuszny?
5. Naczynie musi być opatrzone imieniem i nazwiskiem, napisanymi na maszynie albo dużymi literami.
6. Wycinek powinien być przesłany do pracowni wraz z czytelnie wypełnionym skierowaniem:
W zwykłych warunkach odpowiedź patomorfologa powinna być gotowa 3-4 dni po operacji. Jest to czas niezbędny do wykonania skrawków parafinowych. Niestety są przypadki, kiedy patomorfolog nie jest w stanie zmieścić się w tym terminie. Wynika to z konieczności:
Często jakiś przypadek sprawia trudności klinicyście i nie udaje mu się ustalić rozpoznania nawet w ciągu dłuższego czasu. Histopatolog bywa w podobnej sytuacji, bowiem bogactwo obrazów klinicznych i morfologicznych jest niezamierzone.
Badanie śródoperacyjne wykonuje się tylko wtedy, kiedy uzyskanie przez chirurga rozpoznania histopatologicznego już w czasie operacji decyduje o dalszym jej przebiegu. Jeżeli zmiana okaże się np. nowotworem niezłośliwym, chirurg poprzestaje na jej usunięciu, jeżeli złośliwym 0- musi odpowiednio rozszerzyć zakres zabiegu. Takie badanie wykonuje się za pomocą mikrotomu do zamrażania, wykonanie preparatu trwa 20-25 min, sama diagnoza może się czasem przedłużyć, bo odczytanie grubego skrawka mrożonego bywa trudne. Zdarza się, ż patomorfolog musi odłożyć rozpoznanie do czasu wykonania preparatów parafinowych. Jest to konieczne, aby uniknąć pomyłki, np. błędne rozpoznanie raka naraża na niepotrzebnie rozległą operację i nieuzasadnione trwałe kalectwo.
Badanie śródoperacyjne powinno być uzgodnione z pracownią histopatologiczną, co najmniej dzień wcześniej, aby morfolog mógł się zapoznać z przypadkiem, a pracownia przygotować do wykonania preparatów. W dniu operacji wycinek powinien być dostarczony do pracowni o umówionej godzinie. Natychmiast po wykonaniu preparatu i rozpoznaniu patomorfolog nawiązuje kontakt telefoniczny z lekarzem z Sali operacyjnej i przekazuje wynik, a w ślad za tym dosyła rozpoznanie na piśmie. Obu preparatów rozmowy telefonicznej obowiązuje przedstawienie się, nie wystarcza rozpoznanie po głosie.
Uzyskanie tkanki do badania jest także możliwe przez jej aspirację igłą. Za pomocą igły grubej uzyskuje się wałeczek tkankowy grubości ok.. 1mm i długości do 10 mm. Utrwala się go w formalinie. Aspiracja za pomocą igły cienkiej dostarcza komórki bez zrębu. Z tego materiału wykonuje się rozmaz na szkiełku podstawowym i ten dopiero utrwala, jest więc to badanie cytologiczne.
Specjalnymi instrumentami pobiera się tkanki z:
W ostatnich latach doskonali się badanie cytologiczne złuszczające. Jego celem jest rozpoznawanie zmian, głównie nowotworów, na podstawie znalezienia charakterystycznych komórek w plwocinie, płynach ustrojowych, rozmazach z części pochwowej szyjki macicy i in. Badanie złuszczeniowe nie jest przykre dla chorego, można je powtarzać wielokrotnie. Klinicyści uciekają się do niego bardzo często.
Plwocinę należy zalać 50 % alkoholem etylowym w ilości co najmniej podwójnej w stosunku do objętości. Z tego materiału wykonuje się bloczek parafinowy i rozmaz.
Płyny ustrojowe najlepiej przesyłać bez utrwalenia. Należy je wlewać do naczynia o ścianie zwilżonej heparyną. Przeciwdziała to wytrącaniu się włóknika, utrudniającego wykonanie dobrego rozmazu. Heparyna nie jest utrwalaczem, dlatego trzeba preparat wykonać jak najszybciej po pobraniu płynu. W przeciwnym razie komórki zawarte w płynie rozpuszczają się. Jeżeli nie ma możliwości szybkiego wykonania preparatów, płyn trzeba odwirować i osad zalać 50 % alkoholem etylowym. Jeżeli nie ma czym wirować, powinno się płyn pozostawić na 2 h, tak aby się ustał, usunąć płyn znad osadu, a pozostałość zalać alkoholem 50 %. Z tak przygotowanego materiały robi się rozmaz.
Wszelkie rozmazy można zalać 50% alkoholem etylowym i przesyłać po wyschnięciu albo też włożyć do naczynia z alkoholem etylowym i eterem równych częściach i w tej mieszaninie przekazać do pracowni.
Metody badania mikroskopowego.
1. Barwienia rutynowe.
Barwieniem podstawowym jest barwienie hematoksyliną i eozyną. W większości przypadków wystarcza ono do rozpoznania. Barwienie mucykarminem ujawnia śluz, co jest potrzebne głównie w szczegółowej diagnostyce nowotworów. Barwienie kwasem nadjodowym i odczynnikiem Schiffa ujawnia polisacharydy, dobrze demonstruje błony podstawne i polisacharydowe złogi w komórkach oraz glikogen.
Srebrzenie demonstruje włókienka siateczkowe i błony podstawne. Barwienie azokarminem i błękitem anilinowym wybarwia na niebiesko włókna kolagenowe, a inne tkanki na czerwono. Tłuszcze wybarwia się Sudanem III w skrawkach zamrażanych z materiału utrwalonego lub nie utrwalonego.
2. Badania histochemiczne.
Służą one głównie do lokalizowania aktywności enzymów, natomiast nie nadają się do oznaczania ilościowego. Wykonuje się je na skrawkach mrożonych.
3. Badania immunofluoresencyjne.
Służą do identyfikowania białek w tkankach:
Mają szczególne znaczenie w diagnostyce chorób kłębuszków nerkowych. Przedmiotem badania są skrawki mrożone.
Białko, którego obecność w tkance chcemy potwierdzić jest uważane za antygen. Jeżeli szukamy odpowiedzi na pytanie, czy jest to np. fibrynogen, musimy dysponować przeciwciałem króliczym przeciw fibrynogenowi. Takie przeciwciało jest znakowane fluoresceiną. Jeżeli w badanej tkance znajduje się fibrynogen, przeciwciało wchodzi z nim w reakcję. Dzięki fluoresceinie można to zobaczyć w mikroskopie fluorescyjnym. Najnowsze techniki umożliwiają wykonywanie badań immunofluorescyjnych w preparatach parafinowych.
4. Szczególnej wagi nabrało oznaczanie niektórych składników komórek przeciwciałami monoklonalnymi.
Ułatwiają one lub wręcz umożliwiają precyzyjne zaklasyfikowanie nowotworów złośliwych o dojrzałości małego stopnia, np. odróżnienie mało dojrzałego raka od chłoniaka, rozróżnienie nowotworów o komórkach wrzecionowatych.
5. Osobnym działem diagnostycznym jest wykorzystywanie reakcji zachodzących między kwasami nukleinowymi.
Stosuje się tzw. sondę, czyli krótki łańcuch nukleotydów, będący fragmentem DNA lub RNA. Sonda łączy się z poszukiwanym łańcuchem, co nazywa się hybrydyzacją. Hybrydyzacja umożliwia wykrywanie wirusów i ich typów, identyfikację bakterii, pierwotniaków, grzybów w tkankach. Przez badanie genomu metoda ta ułatwia też rozpoznawanie chorób rozrostowych, zwłaszcza układu krwiotwórczego i ma wielkie znaczenie diagnostyczne.
6. Mikroskopia elektronowa wymaga specjalnej preparatyki.
Z materiału biopsyjnego pobiera się wycinek, utrwala się go w 2,5% roztworze buforowym aldehydu glut arowego, a po wypłukaniu dotrwala w 1% OsO4. Po odwodnieniu utrwala się, zatapia tkankę w eponie i taki bloczek kroi na ultra mikrotomie o szklanym nożu.
