Mechanizmy biosyntezy i uwalniania GnRH
Procesy rozrodcze u samic ssaków zachodzą pod kontrolą wielopoziomowego systemu neurohormonalnego, zwanego osią podwzgórzowo-przysadkowo-jajnikową. System ten funkcjonuje zarówno przez podporządkowanie niższych jego poziomów piętrom nadrzędnym, jak i dzięki tzw. sprzężeniom zwrotnym, czyli oddziaływaniom zwrotnie skierowanym.
Ośrodek przekazywania bodźców z układu nerwowego do systemu hormonalnego organizmu mieści się w podwzgórzu. Ta struktura odgrywa bardzo ważną rolę w integracji dyspozycji neutralnych i hormonalnych prowadzących do aktywności wydzielniczej przedniego płata przysadki mózgowej. Z zakończeń nerwowych usytuowanych w wyniosłości przyśrodkowej są uwalniane neurohormony, które następnie są przenoszone przez system żył wrotnych podwzgórza do przysadki. Najbardziej istotnym peptydem wpływającym na aktywność gonadotropową przysadki jest dziesięciopeptyd – gonadadoliberyna zwana GnRh albo LH-RH.
Już w 1962 r. podjęto pracę nad izolacją i określeniem właściwości związku stymulującego uwalnianie LH. Preparat zawierający LH-RH otrzymano w postaci oczyszczonej 6000 razy i był on całkowicie pozbawi0ony oksytocyny i wazopresyny. Określono również, LH-RH jest krótkim peptydem zasadowym, niewrażliwym na gotowanie w rozcieńczonym kwasie solnym w ciągu krótkiego czasu. Nie ulegał również inaktywacji pod wpływem substancji redukujących mostki siarczkowe. Substancja ta indukowała owulację po doprzysadkowym wprowadzeniu u samic królika oraz u owiec. Od chwili odkrycia tego związku do określenia jego pełnej struktury minęło 10 lat. Przyczyną tego opóźnienia było to, że w pracy nad izolacją substancji czynnej muszą być stosowane specyficzne i powtarzalne metody oznaczania aktywności biologicznej, ponadto LH-RH jest obecny w podwzgórzu w bardzo małych stężeniach. Aby wykonać całkowite oczyszczenie i charakterystykę strukturalną tej substancji, należało zgromadzić setki tysięcy podwzgórz. Tego dzieła dokonał zespół badawczy Schally’ego, który w 1971r. oznaczył strukturę chemiczną LH-RH w preparacie z podwzgórz świń.
Określenie struktury chemicznej LH-RH otworzyło drogę do chemicznej syntezy tego peptydu i otrzymania go w większych ilościach. Nastąpił okres intensywnych badań fizjologicznych nad tym hormonem. Wykazano, że uwalniania on także FSH z przysadki. Stwierdzono również, że degradacja tego peptydu przez enzymy zachodzi przez rozszczepienie wiązania peptydowego między glicyną a leucyną oraz przez odłączenie od peptydu C-końcowego dwupeptydu PRO-GLY-NH2. Zamiana glicyny w łańcuchu na D-aminokwasy dała analogi o podobnej aktywności biologicznej, ale mniejszej podatności na hydrolizę.
GnRH jest syntetyzowany głównie jako część większej struktury, pro hormonu, w neuronach części przedwzrokowej podwzgórza. Jego gen u szczura składa się z 4 eksonów i 3 intronów zawartych w 4,5 KB DNA. GnRH jest syntetyzowany po transkrypcji genu i utworzeniu specyficznego mRNA dla prohormonu. Po rybosomalnej syntezie prohormon podlega wielu modyfikacjom, włączając:
• ograniczoną proteolizę,
• trawienie egzopeptydazą,
• amidację C-końca łańcucha.
Proces potranslacyjnej obróbki prekursora GnRH odbywa się stopniowo i w sposób wielce zorganizowany, a enzymy niezbędne do zakończenia formowania aktywnego deka peptydu są obecne w pobliżu prohormonu podlegającego dojrzewaniu. Początkowo sekwencja aminokwasów w pre-pro-GnRH została określona na podstawie cDNA. W strukturze prohormonu znajdują się sekwencje GnRH oraz 56 aminokwasowego peptydu zwanego peptydem towarzyszącym GnRH, który również wykazuje aktywność biologiczną. Zarówno GnRH, jak i GAP są w tym samym czasie uwalniane do krwi systemu wrotnego kastrowanych owiec, co potwierdza przypuszczenie, że GAP jest produktem reakcji zachodzących w granulach sekrecyjnych podwzgórza. Wykazano, że w granulach sekrecyjnych podwzgórza u bydła jest obecny specyficzny enzym biorący udział w dojrzewaniu białka pro-GnRH. Enzym uwalniający GAP hydrolizuje wiązania w miejscu zachodzących na siebie sekwencji GnRH i GAP. Enzym ten jest zależną od metali dwuwartościowych neutralną proteazą serynową i jest związany z błoną granul sekrecyjnych. Wykazano również, że oprócz enzymu uwalniającego GAP w granulach sekrecyjnych jest monooksygenaza amidująca peptydylo-glicynę i karboksypeptydazy E, która daje peptyd z wolną glicyną w pozycji 11.
Glicyna ta jest substratem dającym grupę NH2 do amidacji glicyny w pozycji 10. Początkowa reakcja rozszczepienia białka katalizowana przez enzym uwalniający GAP – zachodzi przed transportem aksonalnym, prawdopodobnie w aparacie Golgiego, gdzie pH jest jeszcze obojętne. Następne etapy „dojrzewania” zachodzą już wewnątrz formującej się granuli i w granuli w pełni uformowanej. Obecność GnRH i GAP w granulach sekrecyjnych potwierdzono immunocytochemicznie u szczura i naczelnych.
GnRH jest uwalniany z zakończeń nerwowych wyniosłości przyśrodkowej w odpowiedzi na depolaryzację przez jony K. Komórki nerwowe zawierają szereg receptorów dla neuroprzekaźników, które mają wpływ na uwalnianie GnRH. Pulsacyjne uwalnianie GnRH u kastrowanych szczurzyc następuje co 30 minut. Dlatego też sieć neuronów GnRH jest związana z generatorem pulsów albo zawiera taki generator. Zahamowanie aktywności noradrenergicznej przez zahamowanie syntezy noradrenaliny i blokada receptorów alfa-adrenergicznych wywołują zahamowanie pulsacyjnego uwalniania LH u kastrowanych szczurzyc. Świadczy to, że stymulujące działanie noradrenaliny następuje za pośrednictwem receptorów alfa.
Struktura okolicy przedwzrokowej i podwzgórza, lokalizacja GnRH i szlaki aferentne
Aferentne połączenia neuronów GnRH w okolicy przedwzrokowej z układami neutralnymi regulującymi uwalnianie GnRH
W podwzgórzu i obszarze przedwzrokowym znajdują się struktury powiązane z ośrodkową regulacją aktywności systemu GnRH – ergicznego, który odgrywa główną rolę w funkcjonowaniu osi podwzgórzowo-przysadkowo-gonadalnej. U większości gatunków zwierząt komórki GnRH regulujące aktywność sekrecyjną LH i FSH w komórkach przysadki są zgrupowane w okolicy przedwzrokowej, przekątnej wstędze Broca, narządzie naczyniowym blaszki końcowej. Aksony tych neuronów, przechodząc przez brzuszno-przyśrodkowe podwzgórze do zewnętrznej warstwy wyniosłości przyśrodkowej, tworzą szlak okołokomorowy. W warstwie zewnętrznej wyniosłości przyśrodkowej neurohormon GnRH jest uwalniany z zakończeń nerwowych do naczyń włosowatych stanowiących część podwzgórzowo-przysadkowego krążenia wrotnego. Aktywność sekrecyjna neuronów GnRH jest regulowana przez liczne układy neuralne produkujące neurotransmitery, neurohormony i peptydy zarówno o charakterze stymulującym, jak i hamującym uwalnianie GnRH.
Liczne badania nad neuroendokrynnymi procesami regulującymi sekrecję GnRH wykazały, że uwalnianie tego hormonu zachodzi przez mechanizmy neuralne zarówno na poziomie ciał komórkowych, jak i zakończeń nerwowych tych komórek. Neurony GnRH mają liczne połączenia synaptyczne z neuronami:
• noradrenergicznymi,
• GABA-ergicznymi,
• beta-endorfinergicznymi,
• NPY-ergicznymi,
• CRH-ergicznymi.
Wpływ niektórych układów neutralnych w podwzgórzu na uwalnianie GnRH/LH
Układ noradrenergiczny
Liczne badania wykazały, że neurony noradrenergiczne pnia mózgu odgrywają istotną rolę w regulacji cykli estralnych przez kontrolę tonicznej sekrecji gonadotropin i wyrzutu przedowulacyjnego LH. Układ noradrenergiczny zawiera receptory estrogenowe i łączy się synaptycznie z komórkami GnRH. Tylko mały procent komórek GnRH zawiera receptory estrogenowe, dlatego układ noradrenergiczny jest jednym z istotnych układów neutralnych w podwzgórzu, uczestniczących w mechanizmie negatywnego i pozytywnego wpływu estrogenów na uwalnianie GnRH.
Jak istotny jest wpływ estrogenów na funkcje układu noradrenergicznego w uwalnianiu GnRH uwidacznia to, że infuzja noradrenaliny do komory III mózgu u owiaektomizowanych szczurzyc hamuje uwalnianie LH, natomiast u owariektomizowanych szczurzyc, którym podano estradiol, noradrenalina stymuluje sekrecję gonadotropin. Podobnie u owiec w okresie ancestralnym, u których poziom estradiolu jest niski, układ noradrenergiczny hamuje sekrecję GnRH/LH, natomiast u owiec astralnych – przed owulacyjnym wyrzutem LH – stymuluje uwalnianie GnRH. Układ noradrenergiczny ma bezpośrednią łączność z neuronami GABA w okolicy przedwzrokowej, zatem może również pośrednio oddziaływać na uwalnianie GnRH przez układ GABA-ergiczny.
Układ serotoninergiczny
Mimo licznych badań nad rolą układu serotoninergicznego jąder szwu w regulacji sekrecji ginadotropin u różnych gatunków zwierząt, nie można sformułować jednoznacznych wniosków. Wyniki sugerują, że funkcja układu serotoninergicznego w kontroli sekrecji gonadotropin może być różna u poszczególnych gatunków zwierząt. stwierdzono, że u owcy i królika układ serotoninergiczny hamuje sekrecję LH, natomiast u świnki morskiej ją aktywuje. Z prac wykonanych na szczurach wynika, że w zależności od stanu fizjologicznego zwierzęcia układ serotoninergiczny może odgrywać rolę zarówno stymulującą, jak i hamującą.
Układ dopaminergiczny
Dotychczasowe wyniki badań wskazują, że układ dopaminergiczny podwzgórza pełni zarówno funkcję stymulującą, jak i hamującą sekrecję LH. Układ dopaminergiczny jądra łukowatego hamuje uwalnianie GnRH, natomiast układ dopaminergiczny warstwy niepewnej – podwzgórza stymuluje sekrecję tego hormonu. tylko nieliczne komórki dopaminergiczne zawierają receptory estrogenowe, więc sugeruje się, że estrogeny wpływają na aktywność układów dopaminergicznych pośrednio przez inne układy neuralne w podwzgórzu.
Układ kotykoliberyczny
Hamujący wpływ kortykoliberyny na sekrecję GnRH/LH został udokumentowany w licznych badaniach na szczurach i małpach. Wykazano, że infuzje CRH do komory III mózgu lub do okolicy przedwzrokowej u szczurów hamują uwalnianie GnRH/LH. Prace immunohistochemiczne potwierdzają tę obserwację wykazując, że wpływ CRH na uwalnianie GnRH może zachodzić za pośrednictwem synaps między aksonami CRH i dendrytami GnRH w okolicy przedwzrokowej. Badani in vitro udokumentowały także hamujący wpływ CRH na uwalnianie GnRH z zakończeń nerwowych komórek GnRH w brzuszno-przyśrodkowym podwzgórzu.
Należy podkreślić, że funkcja układu CRH w regulacji sekrecji GnRH/LH może zależeć od gatunku. Stwierdzono, że u owcy infuzja CRH do komory III mózgu zwiększa częstotliwość impulsów sekrecyjnych LH. Ten stymulujący wpływ w dużym stopniu zależy od poziomu hormonów jajnikowych, a szczególnie od ich ujemnego lub pozytywnego oddziaływania na uwalnianie gonadotropin. Istota różnic między stymulującym i hamującym wpływem CRH na uwalnianie GnRH/LH u różnych gatunków nie jest znana. Sugeruje się, że stymulujący wpływ CRH na uwalnianie GnRH u owcy może się dokonywać bezpośrednio przez działanie na zakończenia neuronów GnRH w brzuszno – przyśrodkowym podwzgórzu oraz przez układ noradrenergiczny w tej strukturze. Stwierdzono, że perfuzja CRH do brzuszno-przyśrodkowego podwzgórza u owiec w fazie pęcherzykowej cyklu astralnego znacznie zwiększa uwalnianie noradrenaliny.
